細菌バイオフィルム内の流体抽出の密度と温度を制御するかどうかは、ポリゴンによって決定されます。

npj Biofilms and Microbiomes volume 8、記事番号: 98 (2022) この記事を引用

874 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

微生物バイオフィルムの特徴は、常在細胞を包み込む細胞外分子マトリックスの自己生成です。マトリックスは環境からの保護を提供しますが、遺伝子発現の空間的不均一性は構造形態とコロニー拡散のダイナミクスに影響を与えます。枯草菌は、バイオフィルムの成長と発達に必要な調節経路と重要な構成要素を明らかにするために使用されるモデル細菌系です。この研究では、下にある寒天基質からの液体の抽出によって促進される、バイオフィルム形成の初期段階における非常に活性な細菌集団の出現について報告します。私たちは、この液体抽出の起源をポリ-γ-グルタミン酸 (PGA) の生成にまで遡ります。鞭毛依存性の活動は、バイオフィルムの境界から内部に向かって伝播する流体の移動前面の背後で発生します。体液の増殖の程度は、細胞外多糖類 (EPS) の存在によって制御されます。また、PGA 産生は高温と正の相関があり、その結果、B. subtilis に典型的に関連するしわ状コロニーバイオフィルム構造とは異なる高温成熟バイオフィルム形態が得られることも見出しました。以前の報告では、PGA 産生は非家畜化分離株 NCIB 3610 のバイオフィルム形態に主要な役割を果たしていないことが示唆されていましたが、我々の結果は、この株が環境条件に応答して異なるバイオフィルムマトリックスを生成することを示唆しています。

環境によって課せられるストレスを軽減するために細菌が採用する一般的な戦略は、バイオフィルムとして知られる固着性のコミュニティで共存することです。単細胞生活から多細胞生活への移行により、住民は刺激に対する反応を調整し、代謝負荷を共有し 1、捕食者 2,3 や抗菌剤 4,5 による外部攻撃から身を守ることができます。この挙動は微生物界全体に遍在しており、バイオフィルムの発生、発達、成熟を明確に理解することは、基本的な微生物学的観点からだけでなく、多くの産業、臨床、バイオテクノロジー分野への影響からも重要です。たとえば、バイオフィルムは多くの慢性感染症の発生源として機能し、その物理的特徴により根絶が困難になります6,7。この譲れない姿勢は工業プロセスにも影響を与える可能性があり、バイオフィルムがパイプの詰まりを引き起こしたり、腐食を誘発したり、製品を汚染したりする可能性があります8、9、10。しかし、バイオフィルム形成には多くの悪影響がある一方、微生物バイオフィルムは廃水処理やその他のバイオレメディエーションプロセスにおいて重要な役割を果たしており 11,12,13,14 、その形成とその破壊を理解することは根本的な関心事です。

Bacillus subtilis は、バイオフィルム形成の遺伝的調節と分子機構を研究するためのモデル生物として広く使用されているグラム陽性菌です 15,16。 B. subtilis によって生成されるマトリックスの主成分は、線維状タンパク質 TasA17、ハイドロフォビン様タンパク質界面活性剤 BslA18、19、20、および epsA-O オペロンの産物によって合成される多糖 21 です。これらの成分の発現を制御する主要な調節経路の 1 つは転写因子 Spo0A によって調節されており、中程度のレベルのリン酸化 Spo0A は sinI-sinR オペロンの転写を活性化します 22,23。 SinR は、epsA-O および TapA-sipW-tasA プロモーターと相互作用することによってマトリックス生成を制御する DNA 結合転写因子です 24。 SinR がそのアンタゴニストタンパク質 (SinI および SlrR) に結合すると、これらのオペロンによる抑制が緩和され、バイオフィルムの形成が進行する可能性があります 25,26。

この研究では、B. subtilis コロニーバイオフィルム形成の初期段階で発生する複数の移動流体フロントの観察について報告します。創始細胞の最初の沈着に続いて、下にある寒天基質から抽出された液体中を泳ぐ、非常に運動性の高い細菌の集団が出現します。私たちは、この流体のフロントの動きをポリマーポリ-γ-グルタミン酸（PGA）の生成と遺伝的に結び付けています。我々は、体液の流入が細菌密度と環境温度の両方に依存し、体液浸潤の程度が細胞外多糖類（EPS）の生成によって調節されることを発見した。高温での PGA の生成とそれに伴う流体の抽出は、B. subtilis NCIB 3610 に関連する典型的な構造から逸脱する成熟バイオフィルムの形態に大きな影響を与えます。我々の結果は、B. subtilis が代替物質を生成する能力を持っていることを示唆しています。環境条件に応答する細胞外マトリックス。

各実験の開始時に、B. subtilis 細胞の懸濁液 3 μL (OD600 = 1) を、バイオフィルム促進最小培地である MSgg 寒天上に堆積しました 27。接種後、液滴は蒸発し、その結果「コーヒーリング」堆積パターンが形成されます。最初の液滴の端には高密度の細菌細胞のリングが形成され、内部はよりまばらに存在します（図1a）。この創始細胞の分布は、液滴全体にわたる蒸発速度の違いによって引き起こされ、細胞を内部から液滴と固体寒天の間の境界まで輸送する毛細管流を駆動します 28。私たちの最初の実験は、38℃で増殖させた野生型分離株NCIB 3610を使用して実行され、時間分解画像が収集されました。画像は寒天基板を介したイメージングによって取得されたため、バイオフィルムの下側での成長のダイナミクスを観察しました（図1a）。成長の最初の〜6時間の画像を取得しました（図1b〜d）。高密度の「コーヒーリング」領域は、コロニーの外側の境界近くに細菌細胞が大量に蓄積していることで明確に識別できます（図1b）。この細菌の高密度領域は、幅 75 ～ 100 μm の多層になっているように見えます。

a 細菌懸濁液の 3 μL の液滴を MSgg 寒天の表面に置き、乾燥させます。液滴の表面全体での蒸発速度の違い (青い矢印) により、液滴の内部に毛細管流が誘発されます。これにより、細菌が液滴の内部から細菌が付着する端まで移動することが可能になります。この効果は、液滴と固体寒天の間の接触線における細菌の高密度領域の蓄積です。 b この細菌の高密度領域は、コロニーの端に見られます (t = 60 分)。 c 3 時間のインキュベーションと成長の後、出現したバイオフィルムの端を中心に暗い領域が発達します。このゾーンは流体であり、コロニーの中心に向かって内側に移動し始めることがわかります (青い矢印; t = 220 分)。このゾーンでは、活動的で運動性のある細胞が観察されます。 d さらに 2 時間後、白い破線で示されるように前線の内側への移動が止まり、運動が停止します (t = 330 分)。スケールバー (b) ～ (d) は 500 μm です。 e PIV 解析は、2 フレーム (10 fps) 間隔にわたる野生型バイオフィルムの速度マグニチュードフィールドを示しています。青い領域はコロニーのバイオフィルムです。赤い部分が寒天です。画像は堆積後約 4.5 時間で撮影されました。 f 粒子追跡ソフトウェアを使用して、ビーズの位置が特定され (ピンク色)、その動きが経時的に追跡されます (黄色の線)。ビーズの大部分は、コロニーの内部に向かって一定の速度で直線的に移動します。堆積後約 200 分で撮影された画像。スケールバー (e) – (f) 100 μm。

NCIB 3610 が約 3 時間増殖した後、高密度領域から現れた、コロニーの内部とは視覚的に異なるゾーンが観察されます (図 1c の明るい内部と比較した端の暗い環状部を参照)。。この暗いゾーンは成長し、コロニーの中心に向かう移動前線として内側に移動します (補足ムービー 1)。このゾーン内では、渦巻きや渦などの自己組織化された動きの一貫したパターンが観察され、活動的な乱流システム (補足ムービー 2) で観察される構造を彷彿とさせます 29,30 。これは、細菌が現在流体環境にいることを示しています。この動きをさらに評価するために、粒子画像流速測定法 (PIV) を使用しました。渦度が高く、速度が1〜10μm / sの範囲で平均2.1μm / sの局所的な領域が見つかりました（図1e、補足図1、補足ムービー3、4）。これらの出現パターンが流体の流れによる細菌の受動的移流によるものなのか、それとも細菌の運動性が関与しているのかを判断するために、我々は同様の実験と、細菌の運動に必要な鞭毛固定子要素であるmotBを欠失した非運動性株に対してPIVを行った。鞭毛の回転。 NCIB 3610の場合とは異なり、渦が観察されないことがわかりました（補足図2）。さらに、motB 株の平均速度は NCIB 3610 よりも 1 桁小さいです (補足図 2、3)。これらの観察は、活動的な鞭毛または運動性がこれらの動的特徴の形成に重要であるという考えを裏付けています。これらのパターンが細菌の運動性 29 による活発な乱流の一例なのか、それとも鞭毛の鼓動と下の寒天からコロニーへの液体の流れとの結合によるものなのかは、この研究の範囲を超えています。いずれにせよ、これらの結果は、コロニー成長のこの段階の細菌が流体環境にあることを示しています。この運動性/活動の停止は、伝播前線 (「運動停止前線」) としても発生しますが、初期の流体の伝播よりもはるかに速く移動し、主に線維輪の内側リングから外側の初期コーヒーリングに向かって戻ります。 (これらのダイナミクスの注釈付きムービーについては、補足ムービー 5 および 6 を参照してください)。

この流体フロントをさらに調べるために、実験の開始時に堆積した細菌の懸濁液に2μmの蛍光ビーズを追加しました（図1e、補足ムービー7）。流体の流入により、ビーズは約2.5μm min-1の一定速度で押し進められます（図1f）。したがって、このフロントの動きは、ビーズ、およびおそらく細胞をコロニーの中心に向かって移動させ、機械的に押す能力を持っています。後の段階では、一部のビーズの動きが不安定になります。これは、流体環境内での細菌の遊泳作用によってビーズが動き始めたことを示している可能性があります。ビーズのさらに一部は細菌塊内に埋め込まれたままになります。

我々は、コロニー全体が液体で満たされるのではなく、バイオフィルムの外縁から始まる液体環の形成を一貫して観察した。我々は、体液が外側の環状部に制限されるのは、バイオフィルムの中央領域内での細胞外マトリックスの生成によるものであり、体液のさらなる侵入が防止されるのではないかと仮説を立てています。バイオフィルム形成の重要なリプレッサー（sinR）が欠失している株を使用して、図1aに記載されているのと同じ実験を実行しました。 sinR がないと、細菌は細胞外マトリックスを過剰に生成し、しわの多いコロニーバイオフィルムが占める面積は小さくなります（補足図 4）24。予測どおり、sinR 株のコロニーの外縁に対して流体がバイオフィルムの内部に侵入した最大距離 (補足図 5、6; 補足動画 8) は、NCIB 3610 株の約 3 分の 1 でした (図2）。

プロットされているのは、バイオフィルムの端から測定した液体移動の平均距離です。 NCIB 3610、sinR、tasA、bslA 株と epsA-O 株の間の違いを示すために、Y 軸は対数スケールになっていることに注意してください。各データポイントは、個々のバイオフィルム全体の 10 の空間ポイントで平均化された平均流体移動距離です (各株について N = 3)。エラーバーは標準偏差を表します。 epsA-O 株の場合、境界から出る流体は環状に限定されず、中心で合流するため、流体が移動する距離は単にコロニーのサイズを反映していることに注意してください。ここでは、3 つの別々の実験の距離を報告します。 NCIB 3610 と各マトリックス変異体の対応のない t 検定では、****p < 0.0001 (sinR)、****p < 0.0001 (tasA)、**p = 0.0025 (bslA、***) の p 値が得られます。 *p < 0.0001 (epsA-O))。 p < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

次に、マトリックスの 1 つまたは複数の個々の成分が流体流束の程度の制御に支配的であるかどうかを判断したいと考えました。我々は、BslA (bslA)、TasA (tasA)、および EPS (epsA-O) の生成に関与する遺伝子に欠失をもつ菌株に対して同様の実験を行い、再び流体の移動距離を測定しました。我々は、NCIB 3610と比較してbslA株では流体がより多く移動する一方、tasA株では流体の流れがより少ないことを発見した（図2、補足図5、7、8;補足動画9、10、11）。 NCIB 3610 とこれらのマトリックス成分間の差異は統計的に有意ですが、流体は依然としてコロニー内の環状領域に含まれています。ただし、epsA-O 株の場合、流体は環状領域に限定されず、コロニーの半径全体に伝播し (図 2、補足ムービー 12)、どこでも細胞活動が観察されました。活動は非常に動的であり、活発な乱気流に特徴的な渦の形成が観察されました（補足動画 13）。再度、PIV分析を実行し、野生型株と同様の高い渦度および速度分布の領域を発見しました（補足図9、補足動画14、15）。運動停止フロントは、epsA-O 変異体でより明らかであり、流体伝播フロントと同様に、コロニー全体を移動します (epsA-O バイオフィルムダイナミクスの編集および注釈付きムービーについては、補足ムービー 16 および 17 を参照してください)。我々のデータを総合すると、EPS がバイオフィルムへの体液侵入の程度を制御する主要な細胞外マトリックス成分であることが実証されています。

epsA-O 株を使用すると、時間分解方法でコロニー全体にわたる液体の流れを追跡し、液体抽出プロセスについて詳しく知ることができました。流体が内側に伝播するにつれて、指のような不安定性が生じることに気づきました（図3a;補足ムービー8、16〜18）。流体がコロニーの中心に向かって押し込まれると、流体フロントが不安定になり、時間の経過とともにますます大きなフィンガーが形成されます（図3a、b）。これらの不安定性によって形成されるパターンは、成熟したバイオフィルムで観察されるしわのパターンを思い出させます。

a epsA-O バイオフィルム全体の顕微鏡画像の例 (スケールバーは 500 μm)。環状の黒い領域は、指のような不安定性が観察される領域を定義します。この環状領域は、視覚化を容易にするために直線状になっています。赤い線でカットが行われ、円形領域が「展開」されて線形領域が形成されます。 b (a) のバイオフィルムの経時的な指の二値化画像。 c コロニーの外縁 (黒丸)、流体フロント (緑の菱形)、および運動停止フロント (オレンジ色の四角) の時間の関数としての正規化された変位。エッジの拡大におけるプラトーは、流体の伝播の開始と同時に発生します (これを「流動プラトー」と定義します; 赤いボックス)。運動性が停止した後、成長が再開されます。緑色の曲線は、(a) で指が発達するのを観察した時間に対応します。

この方法でコロニーバイオフィルム内の流体の流れを画像化することにより、ダイナミクスの 3 つの重要な特徴を完全に追跡することができました。(1) 成長するコロニーの拡大する外縁が移動する距離。（２）上記のように、流体束が移動する距離。 (3) 運動停止前線。すべての測定値は各フィーチャの初期位置 (r0) を基準にして取得され、時間依存の変化を直接比較できるように、相対距離は最大値で正規化されました。まず、図 3c に示すように、遅延時間の後、コロニーの外縁が一定の速度で拡大し始めます。しかし、この外側への膨張は減速し、ちょうど流体フロントがコーヒーリングからコロニーの内部へ伝播し始めるのが見えるタイミングで失速します。我々は、液体の流入により内部バイオフィルム塊の「流動化」が引き起こされ、その結果生じる機械的堅牢性の欠如がバイオフィルムのさらなる外側への拡大を妨げると示唆する。バイオフィルムの外縁でさらなる拡大が起こるのは、運動停止フロントの開始と内部の再固化によってのみです。流体の流入によるバイオフィルムの拡大のこの一時停止を「流動プラトー」と呼びます（赤いボックス、図3c）。これをバイオフィルムの特性の変化を調べるために使用できます。

流体フロントが主に「コーヒーリング」からコロニーの中心へ放射状に移動していることは印象的である。これは、体液抽出に関与する分子種が細胞密度に依存して生成されることを示唆しています。この仮説を検証するために、細菌の懸濁液を寒天上にスピンコーティングすることにより、初期高密度領域を含むコロニーバイオフィルムと含まないコロニーバイオフィルムを調製しました。細胞が不均一に分布しているサンプル (コーヒーリングのような) では、常に方向性を持って流体が抽出されます。つまり、流体は常に高密度領域から低密度領域に伝播します (補足ムービー 19、20)。対照的に、細胞の均質な沈着は、最終的に、増殖の方向性なしに、コロニーのあらゆる場所に同時に入る液体をもたらします（補足ムービー 21、22）。これらの発見は、体液抽出を誘導するために必要なある程度の臨界細胞密度が存在することを示しています。

私たちは、流体の流れとそれに続く活性と成長のダイナミクスの駆動に関与する分子種を特定したいと考えました。サーファクチンは明らかな候補でした。サーファクチンは枯草菌によって生成されるリポペプチドであり、強力なバイオサーファクタント 31 であり、強力な抗菌剤 32 です。 B. subtilis バイオフィルムにおけるサーファクチンの産生は、コロニーの拡散を促進し 33、下にある寒天基質からの液体の浸透圧抽出において重要です 34。サーファクチンが観察された動態の原因物質であるかどうかをテストするために、野生型およびepsA-Oバックグラウンド株からsrfAAを削除しました。診断として、エッジの初期位置r0に対するバイオフィルムエッジの相対変位rを時間の関数として測定しました（図4a）。サーファクチンが成長するバイオフィルムへの体液の流入に関与している場合、srfAA の欠失によりコロニーの拡大が妨げられないはずです。しかし、我々は、srfAA株とsrfAA epsA-O株の両方が、親株によって示される特徴的な「流動プラトー」を示すことを発見しました（図4a）。したがって、サーファクチンは観察された体液抽出の原因物質ではありません。

a 38 °C での外縁変位の測定により、NCIB 3610 (黒丸)、epsA-O (緑色のひし形)、srfAA (紫色のプラス)、および srfAA epsA-O (灰色の星) 株が特徴的な「流動化」を持っていることが示されています。高原'。 PGAを生成できないpgsBマイナス株（オレンジ色の四角）およびpgsB epsA-Oマイナス株（シアン色の十字）は、この挙動を示さなかった。 b NCIB 3610、c pgsB、d srfAA、e epsA-O、f pgsB epsA-O、および g srfAA epsA-O の 38 °C で 48 時間インキュベートした後のコロニー形態。スケールバーは5mmです。

ポリ-γ-グルタミン酸は、バチルス属の種によって生成される、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、またはその両方の繰り返し単位からなる天然に存在するバイオポリマーです35、36。 PGA の生成は密度に依存し 37、我々の観察と一致しており、保湿特性を持っています 38,39。 PGA が体液抽出に関与しているかどうかをテストするために、野生型および epsA-O バックグラウンド株から pgsB を削除しました。 PgsB は、PGA 生成に必要な必須の合成酵素です 40。野生型およびepsA-O株のコロニー拡大において流動化プラトーが観察されましたが、2つのpgsB変異体では観察されませんでした（図4a）。 PGA が存在しない場合、バイオフィルムは「流動化」せず、バイオフィルムの拡大は中断されずに継続します。したがって、我々は、PGA が基質から液体を抽出し、運動性とバイオフィルムの流動化の開始を促進する分子因子であると結論付けます。

また、48時間のインキュベーション後にバイオフィルムの形態を画像化したところ、野生型とpgsB変異体が形態学的に類似していることがわかりました（図4b、c）。 2つのepsA-O株も同様に類似していますが、野生型の形態とは異なります（図4e、f）。完全を期すために、サーファクチン変異体バイオフィルムも画像化したところ、srfA株は構造化されているが占有面積が小さいのに対し、二重srfA pgsB変異体は他の非EPS産生株と同様に構造化されていないことがわかりました（図4d、g）。。したがって、上で議論したように、初期のコロニーバイオフィルムへの流体の流入は形態をあまり変化させず、マトリックスの生成が依然として成熟バイオフィルムの構造表現型を支配します。

B. subtilis バイオフィルム形成を調査する他のほとんどの研究は通常、室温から 30 °C の間で行われますが、私たちの最初の分析は 38 °C で行われました。したがって、我々は、PGA 産生は細胞密度に依存するだけでなく、温度にも依存すると仮説を立てました。この仮説を検証するために、野生型、epsA-O、pgsB、および pgsB epsA-O 株を使用して、さらに 30 °C および 42 °C (達成可能な最高温度) の温度で体液流束とコロニーバイオフィルムの形態を調べる実験を繰り返しました。当社の顕微鏡インキュベーター内）。 30℃では、野生型およびepsA-O株を含め、いずれの株でもコロニーバイオフィルムへの液体の流れは観察されず、端の拡大で流動化プラトーも観察されませんでした（図5a）。この結果は、30 ℃では PGA が生成しないことを示唆しています。 38 °C および 42 °C の高温では、PGA を生成できる菌株のエッジ膨張曲線にプラトーが見られますが、高温でのプラトーはそれほど顕著ではありません。 PGA欠損変異体ではプラトーは観察されません（図4aおよび5b）。

a NCIB 3610 (黒丸)、epsA-O (緑色のひし形)、pgsB (オレンジ色の四角)、pgsB epsA-O (シアンの十字) の、30 °C および b 42 °C でのエッジ拡張の測定。 c-f 30 °C、g-j 50 °Cで48時間インキュベートした後のコロニーの形態。スケールバーは5mmです。 k 38 °C および 50 °C で増殖させた後の NCIB 3610 および pgsB から抽出したサンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動による PGA 存在量の分析。

さらに、NCIB 3610が50℃のMSgg寒天プレート上で非常に粘液性のコロニーを形成することも発見しました（図5g）。粘度は、ペトリ皿を逆さにするとバイオマスが蓋の上に落ちるほどでした。 EPSとサーファクチンを産生できないコロニーでも同様の表現型が観察されました（図5h、補足図10）。 pgsB欠失株は完全に非ムコイドであったため、ムコイド表現型がPGA産生と直接関連していることがわかりました（図5i、j）。最後に、同じ株を30℃で検査しましたが、NCIB 3610とpgsBコロニーのバイオフィルム構造の構造に違いは観察されませんでした（図5c、e）。同様に、epsA-O および pgsB epsA-O 変異体は形態学的に同等です (図 5d、f)。表現型データを裏付けるために、38 °C および 50 °C で増殖させた NCIB 3610 および pgsB 株からバイオマスを収集し、PGA の生産を生化学的に評価しました。 3610 は 50 °C では大量の PGA を生成しますが、38 °C では生成しないと結論付けています (図 5K)。 bslA、tasA、およびepsA-Oに欠失を含むNCIB 3610のマトリックス変異体は、50℃で同様にムコイドバイオフィルムを形成します（補足図10）。 sinR に欠失を有する変異体のみが、まだ粘液状であるにもかかわらず、しわの構造的特徴を持つバイオフィルムを生成します（補足図10）。我々のデータを総合すると、PGA は細胞密度と温度の両方に依存して NCIB 3610 で生成されるという結論が裏付けられ、特定の条件下ではバイオフィルムの構造と構造が PGA の生成によって劇的に影響を受ける可能性があることが示されています。

我々は、B. subtilis が成長するバイオフィルムコロニーへの液体の流入を誘導する PGA を生成することを示しました。この液体の上昇は、細胞鞭毛に依存した活動を引き起こし、これらの高密度で閉じ込められた条件では、乱流のダイナミクスをもたらします。運動性細胞とバイオフィルムマトリックス生成細胞の状態は相互に排他的であることが十分に確立されています 41,42。個々のセルは 2 つの状態のうちの 1 つだけを取ることができます。また、グラム陽性種とグラム陰性種の両方について、活発な鞭毛運動がバイオフィルムの発達に必要とされることが多く、その役割は多重であることも証明されている43、44、45、46、47、48。

PGA 誘導性の運動性が B. subtilis バイオフィルムの発達においてどのような機能を果たしているのかはまだ明らかではありません。運動性に必要な同じ転写調節因子 49 が PGA 合成にも必要であることは興味深いです 37,50,51。しかし、これまでの研究では、PGA 合成と鞭毛機能の間には逆相関があることも示されており 52,53 、我々が観察している運動性は単に流体環境にある細胞の副産物である可能性があることを示唆しています。 PGA の合成と運動性を制御する正確な制御機構は複雑であり、この 2 つの関係をより深く理解するにはさらなる研究が必要です。

私たちの実験から、高温によりコロニーが寒天基質からかなりの量の液体を引き出すことが明らかです。これまでの研究では、PGA が細菌に保護を与え、さまざまな環境ストレス下で生存率を高めることができることが示されています 54,55,56,57。バイオフィルムが高温にさらされると、PGA の生成により、蒸発によって失われる可能性のある水分が除去および保持され、コロニーの乾燥が防止されると考えられます。運動性の開始に関する我々の観察は、変化する環境におけるPGA生産のさらなる潜在的な利点を浮き彫りにしている：能動的（または実際には受動的な）拡散は、脱出と定着に適した環境の探索を容易にする可能性がある。

B. subtilis および V. cholerae のバイオフィルムマトリックスは、浸透圧流体の流入によるバイオフィルムの拡大を促進する粘性ヒドロゲルネットワークとしてモデル化されています 58、59、60、61。成長するコロニーの増殖境界における EPS 産生の局在化が、バイオフィルムの外側への拡大を促進すると考えられています。オスモライトの同時生成により体液抽出が刺激され、成長境界でマトリックスが膨張し、運動が前進します。私たちの実験では、PGA は逆の効果があるようです。液体が基質から抽出されるときにコロニーが「液体のような」状態になるため、コロニーの拡大が停滞します。これまでの研究では、コロニーバイオフィルムの拡大が、隣接する細胞間の機械的接触力と下にある基質との摩擦によって強く支配されることが示されている62、63、64。私たちの実験では、流体環境が消散し、物理的接触が回復し、非 PGA マトリックスの生産が開始されたときにのみ膨張が再開されます。これにより、さらなる疑問が生じます。PGA が主なマトリックス成分である場合、コロニーの拡大はどのように起こるのでしょうか? 高温での実験では、野生型 3610 株が初期の堆積フットプリントを大幅に超えて拡大することが示されました。 EPSまたはサーファクチンを産生しない株は野生型ほど拡大せず、これらの成分がコロニーの拡大を促進する役割があることを示唆しています（補足図10）。

epsA-O 欠損ひずみにおける流体の進行波は、波が内側に伝播するにつれて指のような構造の出現をもたらします。このような運指の不安定さは、低粘度の液体が高粘度の液体と置き換わったときに発生する可能性があります。逆の状況では、通常、インターフェイスが安定します。興味深いことに、私たちの実験では、フィンガーは逆の構成で発生します。このような逆サフマン・テイラー不安定性は、空気/流体界面に吸着して界面不安定性を引き起こす可能性のある湿潤性粒子の添加によって発生する可能性があります65。細菌が界面に蓄積する可能性があることが知られており66、枯草菌は浮遊（ペリクル）バイオフィルムを形成することでこれを実証しています。私たちの実験システムでは、B. subtilis 細胞が入ってくる流体波の前面に蓄積し、界面エネルギーが変化し、流体と空気の間の界面が不安定になり、観察されたフィンガリングの不安定性が引き起こされていると考えられます。これらの界面への細胞の局在化によって細胞密度勾配も生じる可能性があり、これが成熟バイオフィルムのパターンとして進化する可能性があります。この異常な現象を引き起こす生物学的および物理的メカニズムと、生態学的環境における考えられる利益や機能を解明するには、さらなる研究が必要となるでしょう。

中間温度（38℃）での我々の実験は、コロニーバイオフィルムの端にあるPGA産生細胞と中央のマトリックス産生細胞との間の空間的分離（以前に報告されているように67）を示唆しており、その結果、コロニーバイオフィルムの環状閉じ込めが生じます。流体。このような空間的および時間的不均一性は、局所的な微小環境が細胞の表現型状態に強い影響を与える可能性があるバイオフィルムに共通の特徴です。バイオフィルム内の表現型の不均一性は、化学的または物理的環境の変動 68,69、遺伝子型の変動、および確率的遺伝子発現 68 から生じる可能性があります。

初期の堆積条件によって課される細胞密度の不均一性、および「コーヒーリング」の形成は、私たちが観察する流体抽出の空間パターンにつながります。ただし、これがバイオフィルム内に密度差を生成する唯一の手段ではありません。液体培養での増殖中に形成された凝集体は、堆積フットプリント全体に高い細胞密度のパッチを播種する可能性があります。実際、我々は、体液の侵入と、推論によると、PGA の生成が「コーヒーリング」から遠く離れた局所的な小さな領域で発生する可能性があることを観察しています (補足ムービー 23)。これは、個々の細胞がマトリックス生成状態よりも PGA 生成状態をとるかどうかを決定する重要な細胞密度があることを示唆しています。

空間的不均一性は 38 °C では一時的であり、EPS は大規模なバイオフィルムの形態を決定する主要なマトリックス成分になります。体液の流れは、バイオフィルムの中央領域にあるマトリックスの EPS 要素の生成によって最終的に停止されます (図 6b)。 EPS 産生細胞に近い運動性細胞は突然動きを停止したように見え、固体前線がコロニーの中央から外側に向かって急速に前進します。この移行を説明できるメカニズムの 1 つは、FliG に結合して運動停止を引き起こす EpsE のような「分子クラッチ」の関与に関係しています 70。ただし、epsA-O 株では運動停止フロントの伝播が観察されるため、EpsE を候補として除外できます。このスイッチのような現象がどのような物理的または生物学的メカニズムによって支配されているかについては、依然として未解決の問題です。

「コーヒーリング」は、寒天表面に堆積した後に形成される高密度の初期領域です。 a 低温により、EPS と TasA (黄色) が豊富なバイオフィルムマトリックスが生成されます。 b 中間温度は PGA 生成 (青色) と、(i) 同時に高密度領域で生じる寒天からの液体抽出を誘導します。 (ii) 流体は中心に向かって伝播し、そこで (iii) EPS および TasA マトリックスの生成がその進行を停止します。 c 高温により、PGA が豊富なマトリックスが生成され、(i) 体液抽出が誘導され、(ii) バイオフィルム全体が覆われ、結果として粘液表現型が生じます。

低温では、中間温度で観察されるような表現型の不均一性は観察されませんでしたが、これはおそらくコーヒーリング内の細胞密度が高いにもかかわらず、PGA産生の欠如によるものと考えられます（図6a）。逆に、高温では、バイオフィルムは異常に粘液性であり、B. subtilis バイオフィルムに典型的な識別可能な構造をまったく欠いています（図 6c）。どちらの極端な場合でも、細胞密度に依存する PGA 産生は、バイオフィルム全体に影響を与える温度依存性の経路に取って代わられます。

sinR に変異を導入して TasA 繊維とエキソ多糖を過剰生産するように操作した場合、高温で形成されたバイオフィルム (補足図 10) は粘液性が高かったが、野生型枯草菌バイオフィルムにより典型的な形態も有していた。。これは、集団内の個々の細胞がいずれかの産物の生産に関与している場合でも、PGA の生産が EPS/TasA と同時に起こる可能性があることを意味します。この 2 つの集団への分岐は、中間温度での我々の発見によって示唆されており、この温度では 2 つの細胞型が同時に存在しているように見えますが、バイオフィルムの異なる領域に存在しています。

これまでの研究では、spo0A が欠失した菌株では、低温 (30 ℃) で粘液性で構造化されていないバイオフィルムが形成され、これは PGA 産生によるものであることが示されています 27,71。したがって、spo0A 変異体は、高温で観察される野生型バイオフィルム表現型を幅広く模倣します。これは、Spo0A が、PGA に富むバイオフィルムマトリックスまたは EPS/TasA に富むバイオフィルムマトリックスの温度依存性生成を制御する調節成分である可能性があることを意味します。

総合すると、これらの結果は、B. subtilis が、異なる環境条件に適応するための異なる特性を持つ異なるバイオフィルムマトリックスを生成する能力を持っていることを意味します。 B. subtilis が広範囲の温度で生育できることを考えると、このような戦略は自然環境でも採用できる可能性があります。枯草菌は砂漠の土壌や、容易に 50 ℃の温度に達する堆肥内で見られます。これまで、PGA は B. subtilis NCIB 3610 バイオフィルムのマトリックス成分として重要な要素であるとは考えられていませんでした 37。しかし、適切な条件下では、PGA は、バイオフィルムが高温条件で生き残るのを助ける可能性のある明確な構造的および物理的特性を備えた代替マトリックス成分となり得るようです。

B.サブチリス株を最初にLB培地(1リットル当たり10gのNaCl、5gの酵母抽出物、および10gのトリプトン)中で増殖させた。バイオフィルムを MSgg 寒天 (2 mM MgCl2、700 μM CaCl2、50 μM MnCl2、50 μM FeCl3、1 μM ZnCl2、2 μM チアミン、0.5% v/v グリセロールを補充した pH 7.0、5 mM リン酸カリウムおよび 100 mM MOP) 上で増殖させました。、0.5% w/v グルタミン酸、1.5% w/v Select Agar (Invitrogen) 必要に応じて、抗生物質を以下の濃度で使用しました: クロラムフェニコール 5 μg ml-1、カナマイシン 25 μg ml-1、スペクチノマイシン100 μg ml-1、およびテトラサイクリン 10 μg ml-1。

この研究で使用したすべての株を補足表 1 に示します。この研究で使用したすべての B. subtilis 株は、野生型実験室分離株 NCIB 3610 に由来し、標準プロトコルを使用して構築されました。 SPP1 ファージ形質導入は、ドナー株からレシピエント NCIB 3610 へのゲノム DNA の導入に使用されました。

コロニーバイオフィルムを24時間増殖させ、その時点でバイオマスを寒天表面から収集し、500μlアリコートのBugBuster(登録商標)Mastermix(Merck)に入れた。材料は、23 ゲージの針を繰り返し通過させ、その後超音波処理 (30% 振幅、10 秒) することによって破砕されました。サンプルを 21 °C (撹拌しながら) で 20 分間インキュベートし、4 °C (17,000 × g) で 10 分間遠心分離しました。上清は保持され、PGA と抽出されたタンパク質が含まれていました。サンプルは Pierce BCA タンパク質アッセイキット (Thermo Scientific) を使用して定量し、さらなる分析まで -20 °C で保存しました。

総タンパク質 10 μg を含むサンプル (1x laemelli サンプルバッファーで 25 μl に標準化) を、分子量ラダー (Precision Plus Protein) と並行して SDS-PAGE (12% w/v 分離ゲルおよび 7% w/v スタッキングゲル) によって分析しました。デュアルカラー標準 (Biorad))。すべてのゲルを並行して処理し、サンプルローディング色素の青色色素フロントがゲルの底に到達するまで 180 V で実行しました。アクリルアミドゲルを水で徹底的にすすぎ、インスタントブルークーマシータンパク質染色液（アブカム）に穏やかに揺らしながら１時間浸漬した。染色液中でのインキュベーション後、ゲルを脱イオン水ですすぎ、Molecular Imager Gel Doc XR システム (Biorad) を使用して画像化しました。ゲルをさらに、３％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．５％（ｗ／ｖ）メチレンブルーに１０分間浸漬し、その後、バックグラウンドの非結合色素が除去されるまで脱イオン水で繰り返し洗浄した。

枯草菌株を、1.5% w/v LB 寒天上で増殖させた単一コロニーから 3 mL LB に接種しました。細菌を、ＯＤが１．５〜２に達するまで、２００ｒｐｍの軌道振とうしながら３０℃で増殖させた。細胞培養物を、リン酸緩衝生理食塩水でＯＤ６００が１．０まで希釈した。細菌の３μＬ液滴を、ＭＳｇｇ寒天を含む３５ｍｍペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に堆積させた。細菌の液滴を 10 分間乾燥させました。スピンコーティングによって調製されたサンプルの場合、MSgg 寒天を含むペトリ皿を 2000 rpm で回転する真空スピンコーター (Cammax Precima) 上に置きました。細菌の 10 μL 液滴を回転寒天上に置きました。すべての実験では、温度制御された Nikon Ti 倒立顕微鏡上にペトリ皿を置きました。すべての顕微鏡画像と動画は、μManager ソフトウェアによって制御される CoolSNAP HQ2 CCD カメラを使用してキャプチャされました。バイオフィルムの明視野動画と画像はペトリ皿の下側から撮影され、寒天（厚さ約 4 mm）を通して画像化されます。画像取得には、Nikon Plan 2x UW および 10X Plan Fluor 対物レンズを使用しました。追加のバイオフィルムイメージングは、Leica MZ16 立体視鏡を使用して実行されました。ビーズ追跡実験では、直径 1 μm のラテックスカルボキシレート修飾ポリスチレン黄色蛍光ビーズ (Sigma-Aldrich) をストック溶液から PBS に 1:1000 の比率で希釈しました。堆積の直前に、1 μL の作業溶液を 1 mL の希釈細胞培養物に添加しました。動画は明るいチャンネルと落射蛍光チャンネル (Nikon GFP 蛍光フィルターキューブ) で取得し、ImageJ プラグイン TrackMate (v3.8.0)72 を使用してビーズを追跡しました。画像解析は、ImageJ のフィジーディストリビューションを使用して実行されました。バイオフィルム顕微鏡画像全体は上記のようにキャプチャされましたが、「ペアワイズステッチ」プラグインを使用してつなぎ合わせられた複数のタイルでキャプチャされました。運指の不安定性の画像は、最初に「直線化」ツールを使用して円形領域を直線領域に変換することによって生成されました。デフォルトの ImageJ しきい値メソッドが画像の 2 値化に適用されました。画像全体で強度が異なる場合、画像は同様の強度の領域に分割され、しきい値処理が実行されました。「エッジ検出」ツールを使用して、しきい値処理された画像のエッジを見つけました。エッジが特定された後、内部が塗りつぶされて指の表現が形成されました。画像が分割されている場合は、ImageJ のステッチツールを使用して画像がステッチされました。流体の移動距離の測定は ImageJ で手動で追跡され、平均変位は実験ごとに 10 回の個別の測定にわたって平均されました。研究された各菌株について、3 つの別々の実験が実行されました。エッジとフロントの変位測定は、連続するフレームにわたるフロントの動きを手動で追跡することにより、ImageJ で同様に実行されました。変位は常に各フィーチャの初期位置を基準にして測定されました。 PIV 分析は、PIVlab (v2.39)73,74 を使用して実行されました。画像は最初に、ウィンドウサイズ 20 ピクセルの CLAHE フィルターを使用して処理されました。 64/32 ピクセル、32/16 ピクセル、および 16/8 ピクセルのウィンドウサイズで 3 つの問い合わせパスが使用されました。使用されたサブピクセル推定器は、Gauss 2x3-point でした。偽のベクトル推定を制限するために画像マスクが適用され、平均から 5 標準偏差を超えたベクトルは拒否されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で使用されるすべてのデータは、Edinburgh DataShare (https://doi.org/10.7488/ds/3473) に保管されます。対応する著者へのリクエストに応じて、あらゆるデータも入手できます。

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有益なコメントをくださった M. Porter 氏と F. Davidson 氏に感謝いたします。 NSW および CEM の研究所での研究は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会 (BBSRC) [BB/P001335/1、BB/R012415/1、BB/T00875X/1] によって資金提供されています。

国立バイオフィルムイノベーションセンター、エディンバラ大学物理天文学部、エディンバラ、EH9 3FD、英国

ライアン・J・モリス & ケイト・E・マクフィー

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デヴィッド・スティーブンソン、テティアナ・スクホドゥブ、ニコラ・R・スタンリー＝ウォール

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RJM、NSW、および CEM は実験を計画しました。 RJMとDSは実験を行った。 TS は実験を実施し、細菌株を作成しました。 RJM、CEM、NSW がこの論文を執筆、編集しました。著者全員が論文の最終版に同意しました。

Ryan J. Morris または Nicola R. Stanley-Wall との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Morris、RJ、Stevenson、D.、Sukhodub、T. 他細菌バイオフィルムにおける密度と温度の制御された液体抽出は、ポリ-γ-グルタミン酸の生成によって決まります。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 8、98 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

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受信日: 2021 年 6 月 4 日

受理日: 2022 年 11 月 29 日

公開日: 2022 年 12 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

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