本物 - 貴陽太道工業集団有限公司

Scientific Reports volume 12、記事番号: 18146 (2022) この記事を引用

1137 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細菌バイオフィルムは、静的な表面に付着した、および/または相互に付着した細菌の複雑なコロニーです。細菌バイオフィルムは抗菌剤に対して高い耐性を示し、生命を脅かす院内感染を引き起こす可能性があります。細菌バイオフィルムの形成と増殖を研究する科学界の努力にもかかわらず、細菌と表面との予備的な相互作用、およびその後のバイオフィルムの初期段階の形成は依然として不明である。この研究では、大腸菌および緑膿菌と、未処理のガラス対照表面および抗菌特性で知られる化合物である塩化ベンザルコニウムで処理した表面との相互作用をラベルフリーでリアルタイムにモニタリングすることを紹介します。原理研究の実証は、細菌の拡散、初期付着、および関連する生存率を監視するためのツールとしてコースティクスの光学現象を利用する標準的な倒立光学顕微鏡で実行されました。光学セットアップの分解能の向上により、細菌の動態のモニタリングと特性評価が可能になり、細菌の接着動態と生存能力、およびバイオフィルム形成能力との関係の証拠が得られました。表面に付着した生菌は、顕著な滑りまたは回転力学を示しましたが、表面接触によって死滅した細菌は、一旦表面に付着すると静止したままでした。この動態の違いにより、バイオフィルム形成の早期検出が可能になり、抗菌性の表面とコーティングの効率を定量化できる可能性が得られます。

バイオフィルムは、表面に定着して増殖する複雑で動的な微生物群集です。個々の浮遊状態（溶液中に浮遊する単一の細菌細胞）からバイオフィルムへの移行により、抗生物質に対する細菌の耐性が強化され、不利な条件下でも細菌の増殖が強化されます1。バイオフィルム内では、細菌は、炭水化物結合タンパク質、線毛や鞭毛などの接着構造、および細胞外物質とともに、細胞外ポリマー物質 (EPS) で構成される自己生成細胞外マトリックスに囲まれており、細胞外マトリックスの安定化足場として機能します。バイオフィルムの三次元構造。この構造は細菌に、その成長と繁殖を促進するために必要な適切な量の栄養素を提供し、細胞間の相互作用、DNA 交換を強化し、乾燥、捕食、その他の外部損傷因子からバイオフィルム成分を保護します2。

細菌の付着とバイオフィルム形成のメカニズムは、いくつかの物理的、化学的、生物学的要因によって支配されます。バイオフィルム形成の第 1 段階は、単一の細菌の表面への個々の付着に関係します。個々の細菌細胞は、物理的な力または固有の移動能力によって表面に輸送されます。運動性細菌は、鞭毛などの構造を使用して、走化性、通気性、または走光性の応答に導かれて表面に近づきます。運動性は、表面との最初の相互作用とそれに沿った動きの両方を促進します。一方、非運動性細胞は、拡散および沈降プロセス、または細胞が懸濁している流体の流れによって表面に送られます3。細菌が表面に近づくと、最初の付着は以下によって制御されます。引力と斥力、主にファンデルワールス力と静電相互作用。テクスチャ、粗さ、疎水性などの表面の特性。 pH や温度などの溶液の特性4。しかし、付着した細菌は、流体力学的な力や反発力の結果として、または栄養素の利用可能性に応じて、可逆的付着と呼ばれるプロセスで表面から剥がれ、浮遊状態に再結合する可能性があります5。環境条件が良好な場合、細菌は表面に永久的に付着して EPS を分泌し始め、表面との永久的な結合 (不可逆的接着として知られます) を確立し、さらなる細菌の付着を促進します6。不可逆的に付着した細菌は EPS を分泌し続け、生存、増殖、および凝集に有利なマイクロニッチを形成します。表面に付着した相互作用する細菌の二次元微小コロニーの存在は、バイオフィルム形成プロセスの初期段階を表します。細菌バイオフィルムは、不可逆的に付着した細菌の二次元単層から三次元多層コロニーに発達し、成長を続け、周囲の培地に数百ミクロン突き出ます。このバイオフィルム構造は原始的な循環系として機能し、個々の細胞を結びつけ、栄養素の交換と老廃物の除去を可能にします。この最終段階では、バイオフィルムは、増え続けるバクテリアの数によって引き起こされる圧力や、流体のせん断や摩耗などの外力の作用によって最終的に破壊されます。その後、細菌は周囲の培地に再び分散し、新たな基質に定着して感染することができます (図 1)8。

バイオフィルム形成の 5 つの段階の概略図 8。

米国では細菌バイオフィルムが院内感染の最大 80% を占めており、その適応性と抗生物質に対する高い耐性により、細菌バイオフィルムは医療機器や人間の組織上に容易に形成され、慢性的で生命を脅かす感染症につながる可能性があります9。したがって、バイオフィルムの形成を防止したり、免疫系を活性化してこれらのコミュニティを根絶したりする方法論は、バイオフィルム関連疾患を効果的に制御するために不可欠です。

一連のいわゆる抗菌表面の開発により、細菌バイオフィルムの形成とその後の感染を防ぐためのいくつかの戦略がこれまでに研究されてきた。これらの表面の大部分は、抗菌物質の放出によって接触または近接した細菌を殺すように設計されています（殺生表面）10。

バイオフィルムの形成を特徴づけて防止するための多大な努力にもかかわらず、また関与する力の多様性のため、効果的な抗菌戦略を開発し、それらの抗菌戦略の応用を支援するには、予備的な細菌と表面の相互作用とその後の初期段階のバイオフィルム形成を明確に理解する必要がある。 -vivo と現実のシナリオ。この研究では、細菌を標識することなく、抗菌コーティングの有無にかかわらず、ガラス表面に曝露された大腸菌および緑膿菌の動態と表面相互作用をリアルタイムで監視しました。大腸菌は、グラム陰性、桿状、非胞子形成細菌で、生物工学および産業微生物学の研究のモデル生物と考えられています。ほとんどの大腸菌株は人体に無害であり、温血生物の腸内に存在します。しかし、いくつかの大腸菌株は病原性があり、尿道カテーテルや血管内カテーテル、人工関節、シャント、グラフトなどのさまざまな医療機器の感染の原因となります11。大腸菌バイオフィルムは、皮膚や軟部組織の感染症の原因となることもあります12。緑膿菌は、グラム陰性、桿状、無胞子性、単鞭毛細菌であり、免疫不全の癌患者や重度の火傷や嚢胞性線維症に苦しむ患者に重篤な感染症を引き起こすことで知られています13。

細菌のイメージングは、一般的な明視野顕微鏡で達成できる低解像度と低コントラストを強化するため、蛍光顕微鏡を使用して行われるのが一般的です。しかし、光退色や光毒性などの蛍光顕微鏡の限界と、蛍光色素への曝露によって引き起こされる細菌の機能やプロセスへの影響に関する知識の欠如を考慮して、細菌細胞とその細菌のラベルフリーモニタリングを実行する戦略が開発されてきました。表面への初期接着力。数ある技術の中でも、位相差顕微鏡法は、取得した画像の解像度とコントラストの点で最も効果的なラベルフリー光学技術の 1 つであり、単純な環境と複雑な環境における細菌細胞の 3 次元追跡が可能になります 14。しかし、位相差顕微鏡には、回折光の遅延を担う位相板の存在を特徴とする対物レンズと結合した集光環を備えた特定の集光器を備えた、特殊で高価な光学装置が必要です15。位相差顕微鏡法を補完し、生物有機体の高コントラスト画像を生成できる別の光学技術は、微分干渉コントラスト顕微鏡法です。高解像度とコントラストは、2 つの干渉するコヒーレントビームの使用によって実現されます。この技術は、人間16および細菌細胞17を視覚化することができます。ただし、一連の偏光子とプリズムを備えた特殊で高価な光学セットアップが必要です。

この研究では、細菌集団の腐食性シグネチャを生成することによってイメージングが実行され、いくつかの簡単な調整だけで蛍光標識を必要とせずに、一般的な倒立光学顕微鏡で細菌集団をモニタリングできるようになりました。コースティックスに基づく光学セットアップの高分解能により、大腸菌および緑膿菌の動態の定性的特性評価と、予備的な細菌表面相互作用の検出が可能になり、バイオフィルムの形成と表面での増殖に関する細菌に関するリアルタイム情報が得られます。ターゲットの表面。

研究の目的は、細菌の表面への付着機構を調査し、表面と相互作用する際に細菌が示すダイナミクスとその生存能力またはバイオフィルムを開始する能力との間の潜在的な関係を定性的に特徴付けることであった。この結果は、細菌の動態とバイオフィルムの形成との関係の証拠を提供し、これは抗菌表面の効率の特性評価およびバイオフィルムの初期段階の形成の評価に直接関係する。この研究で説明され採用されている技術を使用すると、リアルタイム画像の形式でデータを生成できるため、in vitro での抗菌表面の効率に関するラベルフリーの費用対効果の高い研究が容易になります。

細菌イメージングは、非運動性大腸菌 ATCC 10536 株と運動性緑膿菌 ATCC 15442 株で行われています。どちらの菌株も抗菌性の研究によく使用されます。細菌の一晩培養物を、必要に応じてルリア・ベルターニ（LB）ブロスまたはリン酸緩衝生理食塩水（1×PBS、pH 7.4）でマクファーランド標準0.5に希釈し、約108 CFU/mLの作業濃度を得ました。細菌を純粋なＰＢＳまたはＰＢＳ中の１０％ｖ／ｖＬＢの溶液で希釈した。 LB の量は細菌の増殖と増殖能力を制限するために最大濃度 10% v/v に制限されており、これにより単一細菌と標的表面との相互作用およびバイオフィルムの形成をより長い時間監視できるようになりました。 LB の下限値により、培地中の栄養素から生成される腐食性の兆候も最小限に抑えられます (たとえば、補足資料の図 1 を参照)。細菌の動態と相互作用は、深い空洞内の細菌溶液 60 μl を使用して、サンプルを環境から隔離するために防振脚 (VIBe、Newport) に取り付けられた標準的な光学倒立顕微鏡 (Axio Observer.Z1 m、Carl Zeiss) でモニタリングされました。 (深さ 250 ± 10 μm) 顕微鏡スライド。顕微鏡には、画像を取得し、最大 30 fps でビデオを記録するためのモノクロカメラ (AxioCam ICm1、Carl Zeiss) とステージトップインキュベーションシステム (インキュベーター PM S1、加熱インサート PS1、温度および CO2 モジュール S1、 Carl Zeiss) は、実験中に存在する温度と CO2 の量を制御します。光学セットアップの分解能は、細菌の腐食性サインを生成するためにパターソンとウィーランによって説明された手順に従って、顕微鏡の通常のセットアップにいくつかの簡単な調整を行うことによって向上しました。腐食性の光学的特徴により、細菌の構造形態の認識、単一の細菌および細菌のクラスターの同定、さらにそれらの相互作用のダイナミクスが容易になりました。走査型電子顕微鏡では、動的相互作用を阻止する細菌集団の乾燥と固定が必要であるため、溶液中の細菌および表面に付着した細菌に関連するラベルフリーの苛性サインを検証するために、対照ガラス表面に曝露された細菌の蛍光画像が取得されました。蛍光光源を使用した同じ光学セットアップで。大腸菌細菌は、溶液中の細菌の生存率を評価するために使用されるよく知られた蛍光キットである LIVE/DEAD BacLight キット (Invitrogen) の蛍光色素 SYTO9 およびヨウ化プロピジウム (PI) で染色されました。 SYTO 9 は、生死したグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方の膜を透過できる緑色蛍光の核酸染色剤であり、PI は膜が破壊された細菌細胞に透過する赤色蛍光の核および染色体染色剤です19。

LIVE/DEAD BacLight キットは 2 つのコンポーネントで構成されています。

成分 A: SYTO 9 色素、1.67 mM/PI 色素、1.67 mM 300 µL DMSO 溶液

コンポーネント B: SYTO 9 色素、1.67 mM/PI 色素、18.3 mM 300 µL DMSO 溶液

キットの両方のコンポーネントは同時に SYTO 9 色素と PI 色素で構成されているため、塩化ベンザルコニウム (BKC) でコーティングされた表面にさらされた細菌集団を染色するために、異なる蛍光色素であるトリパンブルーを使用することにしました。トリパンブルーは膜が破壊された細菌細胞のみを選択的に染色するため、死んだ細胞を識別することができます。

抗菌剤としての BKC の効率と細菌表面の相互作用に対する BKC の効果は、BKC の 0.1% 溶液を脱イオン水に溶かした溶液を一部のガラス表面に塗布することによってテストされました。 BKC で処理した表面を 2 時間放置して、BKC 溶液を完全に蒸発させ、BKC 膜を堆積させた後、細菌溶液を表面に曝露しました。

細菌の動態と細菌の表面との相互作用は、ImageJ プラグイン Trackmate を使用して 20 秒間評価されました。これは、2D または 3D 画像からスポットまたはほぼ球状のオブジェクトを自動的にセグメント化し、それらを経時的に追跡する方法を提供します20。

この研究で細菌を視覚化するために使用された光学セットアップのイメージング能力は、異なる光源を使用する苛性モードから蛍光モードに切り替えてサンプルの同じ領域の連続画像をキャプチャすることにより、蛍光顕微鏡に対して検証されました。図 2 は、苛性モードと蛍光モードで取得した画像の間に目立った違いがないことを示しており、視野内に存在するすべての細菌の光学的シグネチャを生成する苛性技法の能力が確認され、リアルタイムのモニタリングと分析が可能になります。蛍光標識を必要とせずに細菌の動態と相互作用を特性評価します。さらに、コースティクスモードを使用すると、画像化する細菌のマクロスケール構造をより明確に定義できます。

倒立光学顕微鏡を使用して、コースティクスモード (上) と蛍光モード (下) で画像化した同じ大腸菌集団の比較。大腸菌細菌は、LIVE/DEAD BacLight キットの蛍光色素 SYTO9 およびヨウ化プロピジウム (PI) で染色されました。 2 つのイメージング技術の間に大きな違いはありません。コースティクス画像の黒い矢印で強調表示されている 3 つの細菌は表面にはなく、ランダム拡散中に表面に垂直に並んだときに捕捉され、その結果、ほぼ球形の光学的特徴が得られます。

図 3 は、苛性モードと明視野モードを使用して生成された、表面に付着した大腸菌の典型的な光学的特徴の比較を示しています。コースティックモードでは、細菌の主な構造成分、すなわち膜、核様体、およびFtsZ分裂タンパク質を動員するための足場として機能するそれらの間のZリングの認識が可能になり、細胞を収縮させる力を誘発する可能性があります21。

この作業設定で使用した光学倒立顕微鏡で撮影した、大腸菌によって生成された光学的特徴の写真。(a) コースティクスモード。 (b) 明視野モード。

大腸菌と表面との相互作用は、表面と接触する細菌の動態を特徴付けることによって研究されました。標準的なガラス対照と抗菌性 BKC 表面を使用して、細菌と表面の相互作用の範囲を調査しました。標準的なガラスは細菌の付着を可能にするポジティブコントロールであると想定できますが、BKC は抗菌として受け入れられ、付着した細菌を殺すネガティブコントロールとして組み込まれました。細菌がガラス表面に近づくと、予備的な相互作用は主に静電相互作用と流体力学的相互作用によって制御されます。私たちの実験シナリオでは、細菌とガラスの両方が負の表面電荷を帯びています。大腸菌の外膜は、細胞壁のペプチドグリカンおよびリポ多糖のカルボキシル基とリン酸基の解離により負に帯電します22。一方、ガラスは、主に細胞壁の解離により、水溶液と接触すると負に帯電することが知られています。シラノール基23:

細菌と表面との相互作用によって生じる静電気反発力は、最初の付着とは対照的に、細菌を強制的に表面上にランダムに拡散させ、ブラウン運動を示します（図4a）。しかし、ファンデルワールス力（引力）や重力などの他の力が関係しているため、細菌は静電反発力を克服して表面に付着する可能性があります。表面に付着した膜の表面積と、その結果として生じる細菌の動態に応じて、2 つのタイプの付着を区別することが可能です。回転付着は、細菌の一方の端だけが表面に付着し、細菌が回転運動を示す場合です。取り付けられたポールの周りの動き（図4b）。もう1つは、細菌がその長さの一部にわたって表面に付着し、細菌が並進または滑走を示す場合の側方付着です（図4c）。同じ相互作用ダイナミクスが、LB と PBS の両方に分散した細菌でも観察されました (オンラインで利用可能なデータセットの図 S1 ～ S4)。これらのタイプの付着は、大腸菌細菌の可逆的および不可逆的付着を特徴づける目的で、Agladzeらによって最近、明視野顕微鏡を使用して実験的に研究されている。著者らは、側方付着は不可逆的であり、この特異的な付着を経験している細菌はいかなる動きも示さないと結論付けました24。しかし、我々の結果は、たとえそれが横向きであっても、最初の付着は可逆的であることを示している。細菌に作用する力に応じて、付着のタイプは回転から側方へ、またはその逆に変化します（オンラインで利用可能なデータセットの図S5〜S10）。したがって、関与する力や相互作用にはさまざまなものがあるため、不可逆的付着と可逆的付着の区別は、付着した表面積に基づいてではなく、相互作用の時間スケールを考慮して行う必要があります25。この研究では、表面に横から付着した細菌であっても静止しておらず、単に表面に静的に付着しているだけでなく、表面に沿って滑り運動を示すことが観察されました。この段階で、細菌は細胞外高分子物質 (EPS) を分泌し始めると報告されています6。 EPS 層は、ファンデルワールス力や線毛の引力とともに、付着力を強化し、その存在によって影響を受ける細菌の周囲の表面を拡大し、他の細菌の付着を促進する栄養トラップとして機能します。一方、BKCでコーティングされたガラス表面に接触した細菌は表面に静的に付着するだけであり、静的な細菌や死んだ可能性のある細菌からバイオフィルムを開始できる健康な細菌を認識することができます（図4d）。図 5a、6、および 7 は、BKC でコーティングされた表面に曝露された細胞の腐食性サインを示しています。これは、細胞が死んで表面に付着していることを意味する静的なものであることがわかり、トリパンブルーを使用した蛍光分析によって確認されました（図 5b）。、膜が破壊された細胞に浸透できる色素です26。 BKC は、抗菌特性でよく知られているカチオン性界面活性剤です27。堆積すると、表面に正の正味電荷が付与され、細菌の負電荷を引き寄せ、表面に到達すると突然静電気で付着するようになります（オンラインで利用可能なデータセットの図 S11 ～ S13）。さらに、BKC はタンパク質を変性させ、細菌の細胞膜を破壊し、細菌を死滅させることができます 28。

4 つの大腸菌の切片 (紫色の円) の軌跡 (黄色の線): (a) 表面上でのランダムな拡散。 (b) 回転式アタッチメント。 (c) 横方向の取り付け。 (d) 静的付着。 4 つの細菌の動態を約 20 秒間監視しました。スケールバーの長さは5μmです。

トリパンブルーで染色し、BKC 表面に静的に付着した大腸菌を、倒立光学顕微鏡でコースティックスモード (a) および蛍光モード (b) で画像化しました。

死んだ大腸菌によって生成された光学的特徴の写真。

死んだ大腸菌の集団を PBS に分散させ、BKC で処理したガラス表面に 1 時間曝露したもの。スケールバーの長さは20μmです。

大腸菌で行われた分析を緑膿菌でも再現し、緑膿菌が示す鞭毛駆動の運動性が表面との相互作用に影響を与えるかどうかを確認しました。得られた結果は、緑膿菌が表面に近づくと、非鞭毛性大腸菌で観察されるのと同じ種類の動態を示して表面と相互作用することを示唆しています。ガラス制御面に付着した緑膿菌は静止していませんでしたが、取り付けられたポールの周りを回転し始めたり（回転付着、図8a）、表面に沿って滑り始めました（横付着、図8b）。しかし、鞭毛の存在により、表面に付着した細菌の運動範囲が拡張され、その結果、表面に沿ったより明らかな回転または横方向の動きが生じるようです（オンラインで利用可能なデータセットの図S15-S16）。

緑膿菌の切片 (紫色の円) の軌跡 (赤い線): (a) ロータリーが取り付けられている。 (b) 横方向に付着したもの、および (c) 静的 (死んだ) もの。死んだバクテリアは静電気で表面に付着し、時間が経っても目立った痕跡はなくなりました。 2 つの細菌の動態を約 20 秒間監視しました。スケールバーの長さは5μmです。

大腸菌に関しては、BKCでコーティングされたガラス表面に曝露された緑膿菌でさえ、突然表面に静的に付着し、観察期間中にいかなる動態も示さなかった（図8c、オンライン利用可能なデータセットの図S17〜S18））。

ブラウン運動を示すランダムな運動は図 8 では発生せず、ソリューション内の受動的オブジェクトでは予期されるものであることを観察することが重要です。したがって、表面に付着したバクテリアの回転または直線運動は生命を示しており、動きがない場合は表面に付着した死んだバクテリアを示していると考えるのが合理的であると思われます。

未処理のガラス表面に曝露すると、わずか 2 時間後には 2 つ以上の細菌が整列して互いに相互作用し、二次元コロニーまたはバイオフィルムの第一段階の形成の開始を示します7。細菌は半規則的に整列し、それらを隔てる空間を最小限に抑え、細菌間の接触面を増加させようとしました（オンラインで利用可能なデータセットの図9、図S19-S20）。 24時間後、細菌の濃度とバイオフィルムコロニーのサイズは、溶液中の栄養素の量に比例して増加しました（図10、11、12、13）。三次元コロニーが発達した場合でも、システムのダイナミクスを認識することが可能であったことは注目に値します (オンラインで利用可能なデータセットの図 S21-23)。実際、バイオフィルム形成のこの段階でも細菌は静的ではなく、引き続き EPS を分泌し、表面および相互作用を動的に行います。一方、BKC で処理された表面に曝露された細菌の取得画像は、細菌集団の増殖がなく、バイオフィルムの形成もなかったため、接触時に細菌を殺す抗菌化合物の有効性を実証しました。時間の経過とともに（オンラインで利用可能なデータセットの図14、15、図S24）。

大腸菌が集まってバイオフィルムを形成します。

PBS に分散され、ガラス表面に 24 時間曝露された大腸菌の集団。スケールバーの長さは20μmです。

PBS に分散され、ガラス表面に 24 時間曝露された緑膿菌の集団。スケールバーの長さは20μmです。

10% LB の PBS 溶液に分散させ、ガラス表面に 24 時間曝露した大腸菌の集団。スケールバーの長さは20μmです。

10% LB の PBS 溶液に分散させ、ガラス表面に 24 時間曝露した緑膿菌の集団。スケールバーの長さは20μmです。

PBS 中に分散され、BKC で処理されたガラス表面に 24 時間曝露された死んだ大腸菌の集団。スケールバーの長さは20μmです。

PBS 中に分散され、BKC で処理されたガラス表面に 24 時間曝露された死滅した緑膿菌の集団。スケールバーの長さは20μmです。

この論文では、ガラス表面および抗菌剤でコーティングされたガラス表面を制御するために大腸菌および緑膿菌が示す付着機構の実験的特徴付けを報告しました。この結果は、細菌の生存能力とバイオフィルムを開始する能力が、細菌の動態と表面との相互作用を評価することによって調査できることを示しています。ガラス制御面に付着した健康な細菌は、検出可能な横方向または回転運動を示しました。したがって、これらの挙動を観察することで、潜在的なバイオフィルムの発生を早期に認識することができます。一方、死んだ細菌は、静電気引力と外膜の劣化の結果として、BKC で処理された表面に静的に付着しました。私たちの発見は、リアルタイムでの細菌と表面の相互作用についての新たな経験的洞察を提供するだけでなく、バイオフィルムの初期形成や抗菌コーティングの効率の研究にも潜在的な意味を持ちます。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、DataCat リポジトリ (https://doi.org/10.17638/datacat.liverpool.ac.uk/1631) で入手できます。

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FG は、英国工学物理科学研究評議会からの博士課程学生制度の形での資金提供に感謝します。

リバプール大学工学部、ブラウンローヒル、リバプール、L69 3BX、英国

フランチェスコ・ジョルジ、ジュディス・M・カラン、アン・A・パターソン

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FG は JMC と EAPFG の直接監督の下で実験を実施し、原稿の初稿を作成し、すべての著者が最終版の作成に貢献しました。すべての著者が原稿の最終版に承認を与えました。

フランチェスコ・ジョルジへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Giorgi, F.、Curran, JM & Patterson, EA 細菌の動態と相互作用、およびバイオフィルムの初期形成のリアルタイムモニタリング。 Sci Rep 12、18146 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-22669-0

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受信日: 2022 年 4 月 3 日

受理日: 2022 年 10 月 18 日

公開日: 2022 年 10 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22669-0

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